Биологические основы старения и долголетия - Виленчик Михаил Маркович - Страница 21

Повреждения, возникающие в функционально инертных генах, должны "проявиться" также в тех случаях, когда возникает потребность в их активации, например при гормональной и субстратной индукции синтеза белка и при синтезе антител в ответ на поступление в организм чужеродных антигенов. Во всех этих случаях синтезируемые на "испорченных" матрицах ДНК могут быть функционально неактивными или направлять синтез мутантных белков. Следовательно, рассмотренный процесс накопления повреждений ДНК в тех генах, которые вследствие относительно прочной связи с белками репрессированы (временно или постоянно) и малодоступны для репарации, очевидно, является важной причиной снижения способности старых клеток к индукции синтеза ферментов и антител. Но ведь ранее мы пришли к заключению, что такого рода возрастные изменения определяют уменьшение функциональной способности различных органов, являются характерным признаком старения всего организма. Значит, теперь мы можем определить уровни старения и связи между ними — от молекул до организма.

Существует еще одно обстоятельство, которое делает весьма опасным длительное сохранение в клетках повреждений ДНК. Участки ДНК, содержащие изменения в структуре, вызванные различными повреждающими воздействиями (будь то тепло, ионизирующее или ультрафиолетовые излучения или химические вещества), обладают повышенным "сродством" не только к ферментам, участвующим в репарации этих повреждений, но и к другим белкам. Причем в последнем случае может образоваться химическая, связь (сшивка) между модифицированным участком ДНК и белком (см. рис. 1). После этого клетке труднее провести репарацию ДНК. Более того, такая сшивка ДНК — белок может быть нерепарируемой вообще, что означает необратимое нарушение или, скорее, выключение функции гена.

Ведь независимо от того, в каком синтезе участвует этот ген — в синтезе ДНК или РНК, для обоих этих процессов необходимо, чтобы ферменты, их катализирующие (соответственно ДНК- и РНК-полимераза), продвигались, "скользили" вдоль матрицы. Когда ферменты достигнут участков ДНК, содержащих сшивки ДНК с белком, весьма вероятно, что их продвижение будет остановлено, и, следовательно, редупликация гена, или его транскрипция, окажется незавершенной. Рассмотренный механизм выключения функции гена мы и называем инволюционной репрессией.

В предыдущем издании этой книги автор мог привести лишь один результат изучения изменений ДНК клеток в процессе их старения. Как же продвинулось исследование этого вопроса за прошедшие 11 лет?

Прежде всего обратим внимание на то, что в результате того или иного воздействия на ДНК в ней могут возникать самые различные повреждения, причем в самых различных количествах. Естественно, это очень затрудняет изучение изменений ДНК при старении. Ведь большинство типов повреждений, очевидно, даже к старческому возрасту накапливается в геноме в очень малых относительных количествах (по сравнению с чувствительностью даже самых совершенных методов анализа структуры ДНК). Поэтому, чтобы определить характер повреждений ДНК, возникающих и накапливаемых в геноме клеток при их старении, необходимо теоретически предвидеть наиболее существенные из этих типов повреждений. Об одном способе такого предвидения мы уже рассказали — он состоит в анализе биофизических свойств ДНК и механизмов ее спонтанной (тепловой) нестабильности.

Другой путь — проанализировать характер повреждений ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением или химическими веществами, и попытаться определить общие механизмы возникновения этих повреждений. Если есть теоретические основания полагать, что такие механизмы "работают" и в неповрежденной клетке, то можно ожидать, что и в процессе старения с относительно большой вероятностью можно обнаружить накопление повреждений ДНК сходного типа.

Один из наиболее изученных продуктов, образуемых в ДНК после облучения клеток ионизирующей радиацией или в результате воздействия на нее химическими мутагенами, — это гликоль тимина или тимидина. Такие продукты образуются в результате окислительной деструкции ДНК. Но различные вещества (ОН·,

, Н₂О₂ и т. д.), способные индуцировать процесс окислительной деструкции ДНК, образуются и в процессе нормального метаболизма. Следовательно, можно было ожидать, что такие продукты возникают и в ДНК необлученной клетки. Косвенно об этом свидетельствует выделение этих продуктов с мочой. Так, по данным, полученным методом хроматографии, ежесуточно каждый человек выделяет с мочой в среднем около 32 нМ этих продуктов. У экспериментальных крыс выделение гликоля тимина или тимидина в 15 раз более интенсивно, чем у человека (если пересчитать количество этих продуктов на 1 кг массы тела).

Максимальная (видовая) продолжительность жизни человека, по мнению многих исследователей, составляет примерно 100 лет. У лабораторных крыс она варьирует в зависимости от линии и достигает 4 лет. Иными словами, человек примерно в 25 раз долговечнее, чем крыса. Таким образом, между интенсивностью выделения гликоля тимина и продолжительностью жизни, возможно, существует обратно пропорциональная зависимость.

Модифицированные нуклеотиды или основания сначала выделяются во внутриклеточное пространство в процессе репарации ДНК с помощью ферментов, вырезающих поврежденные участки ДНК. Лишь затем они или продукты их метаболизма выводятся сначала из клетки, а потом и из организма. Но отсюда следует, что, чем больше выводится этих продуктов с мочой, тем больше их образуется и из ДНК клетки. Стало быть, открывается возможность на основании анализа продуктов метаболизма ДНК в моче делать хотя бы косвенные заключения об интенсивности химической модификации ДНК в клетках и роли таких модификаций в развитии различных болезней (особенно опухолей) и в старении.

Теперь я расскажу подробнее о результатах исследований, проведенных нами на культивируемых клетках человека. Повреждения ДНК клеток человека были исследованы при старении этих клеток в организме (in vivo), а также вне организма (in vitro). Кроме того, такие повреждения ДНК были сопоставлены с повреждениями ДНК, возникающими при не очень интенсивном прогревании клеток или облучении их ионизирующим излучением. Рассказывая о наших данных, я познакомлю любознательного читателя с некоторыми особенностями изучения повреждений ДНК "щадящим" методом.

Один из основных методов анализа ДНК, использованных нами при исследовании этих вопросов, — метод седиментации ДНК в градиенте щелочной сахарозы. Этот метод уже упоминался (см. с. 27). Мы сразу перейдем к рассмотрению полученных вместе с А. Н. Хохловым данных, делая пояснения методики при изложении результатов.

На рис. 8 представлены седиментограммы ДНК эмбриональных фибробластов и фибробластов, полученных из кожи 91-летнего донора. На графике указано, какой процент ДНК от общей массы ДНК (содержавшейся в клетках, нанесенных на градиент) был в той или иной из фракций (частей), на которые разделяли содержимое центрифужной пробирки после окончания центрифугирования. 1-я фракция соответствовала дну пробирки, 15-я — верху градиента. Это означает, что высокомолекулярные фракции ДНК — первые, низкомолекулярные — последние номера фракций. И следовательно, чем больше седиментограмма сдвинута вправо, тем меньше среднее значение молекулярной массы ДНК, тем больше в ней было разрывов.

Рис. 8. Профили седиментации ДНК диплоидных фибробластов медицинского абортуса (1) и фибробластов кожи 91-летней женщины (2). Цифры на рисунке — средние значения молекулярных масс ДНК соответствующих клеток